Production de GFP par E Coli

Le but de la manipulation est de transformer une souche d’E Coli K12 avec un plasmide (pGLO) contenant deux gènes d’intérêts, l’un pour la sélection et l’autre pour la mise en évidence de la transformation par synthèse de GFP :
 un gène de résistance à l’ampicilline ;
 un gène codant pour la GFP.

La GFP synthétisé sera ensuite extraite par chromatographie (TP2) puis caractérisé par électrophorèse (TP3)

Eléments de Principe

Principe de la production de GFP par E Coli

Protocole de TP

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Transformation d’Ecoli K12 par le plasmide pGLO

Exemples de questionnement

Autour du principe :

 Définir un plasmide
 Définir la transformation
 Justifier la composition du milieu de transformation
 A quoi sert le choc thermique
 Quels sont les caractères acquis par les bactéries transformées ?
 Citer les deux autres types de transferts de matériels génétiques

Autour de la manipulation

Questionnement préalable

 Quels résultats attendez vous ?

Plasmide+pGLO+pGLO-pGLO-pGLO
Milieu de culture LB/amp LB/amp/ara LB/amp LB
Résultats attendus

 Sur quel(s) milieu(x) allez vous trouver des colonies de E Coli semblables à celles initialement utilisées pour la transformation ?
 Sur quelle(s) boite(s) de Pétri allez vous trouver des cellules bactériennes transformées ?
 Quels milieux pourront être comparés pour déterminer si une transformation bactérienne a bien eu lieu ?
 Quelles différences observez vous entre les résultats des boites +pGLO/LB/amp et +pGLO/LB/amp/ara ?
 Quelles sont les boites de Pétri qui servent de contrôle dans ce test ? Que contrôlent-elles ?

Analyses des résultats obtenus

 Dresser un tableau de résultats en indiquant le nombre, la couleur, la fluorescence des colonies.
 Décrire l’observation de la solution plasmidique pGLO
 Quel est le nombre total de cellules fluorescentes déposées sur le milieu +pGLO/LB/amp/ara ?
 Sachant que sur ce milieu l’équivallent de 0,16µg d’ADN plasmidique ont été déposé, calculer l’efficacité de la transformation (Nbre de transformation/µg d’ADN)

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